Die Proben werden mit Kapillarpipetten aufgetragen. Das sind dünne Glasröhrchen, die in die Probenlösung eingetaucht werden. Durch die Kapillarwirkung saugt sich die Flüssigkeit in die Kapillare.  Dann wird die Pipette vorsichtig - ohne die Schicht zu verletzen - auf die Platte gesetzt. Jetzt ist die Kapillarität der Schicht dafür verantwortlich, dass die Flüssigkeit von der Schicht aufgesaugt wird. Vor der Entwicklung der Platte müssen die aufgetragenen Flecken unbedingt trocknen, sonst stört das Lösungsmittel der Probe die Trennung.  

Üblicherweise werden zwischen 1 und 20 µl aufgetragen. Je kleiner die Probenflecken, desto schärfere Trennungen erhält man später. Die empfindlichsten Verfahren auf Nanoplatten kommen sogar mit 0,01 µl aus. 

Die Proben werden einige mm von dem Rand der Platte entfernt aufgetragen, von dem aus die mobile Phase starten soll - einerseits soll die Platte möglichst gut zur Trennung ausgenutzt werden, andererseits darf die Probe sich nicht im Vorrat der mobilen Phase lösen. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten benutzt man dazu Schablonen.

Diverse Halter erleichtern das Hantieren mit kurzen Kapillarpipetten.

Mit Saughütchen oder anderen Pipettierhilfen kann man bei großen Kapillarpipetten Teilvolumina abmessen.

Platten mit Konzentrierungszone haben am Anfang der Laufstrecke eine 1 bis 2 cm breite Beschichtung aus Kieselgur. In diesem Bereich aufgetragene Proben laufen wegen der geringen Adsorption bis zum Beginn der eigentlichen Trennschicht mit der Fließmittelfront und erscheinen dort als schmales Band. Man erhält eine bessere Auflösung und intensivere Farben nach der Trennung.

Schließlich gibt es automatisierte Geräte, die mittels einer elektrisch geführten Mikroliterspritze oder sogar mit Sprühdüsen die Proben auftragen. Mit ihnen können größere Probenvolumina für präparative Aufgaben auch bandförmig aufgetragen werden.